产品名称：pEGFP-ADRB2(human)质粒
产品规格：05ug质粒干粉

在收到产品后，请根据产品管壁标签确认其形式，并在扩增前详查该质粒菌株的抗性、感受态和培养温度。

EGFP-ADRB2(human)质粒扩增流程

1. 质粒干粉（常温运输，存于-20度，保质期90天）。请务必进行转化挑单克隆培养，不要直接使用或测序。

步骤如下：

1. 收到质粒干粉后，先以5000rpm离心1分钟，然后加入20μL去离子水溶解质粒。
2. 取1支100μL感受态在冰上解冻10分钟，加入2μL质粒，随后冰浴30分钟，进行42℃热激60秒，注意不要搅动，然后再冰浴2分钟。（自第二步起，所有操作须在超净工作台内进行。）
3. 加入900μL无抗的LB液体培养基，在180rpm震荡下于37℃培养45分钟。
4. 以6000rpm离心5分钟，仅保留100μL上清液重悬细菌沉淀，并涂布至目标质粒抗性的LB平板上。
5. 将平板正向培养1小时，随后倒置于37℃培养14小时。如需在30℃培养，则持续20小时。（如菌落过多，需将质粒稀释后再进行转化；如无菌落则加入10μL质粒进行转化。）
6. 挑取单菌落至LB液体培养基中，加入对应抗生素，于220rpm震荡下培养14小时，然后根据实验设计和质粒提取试剂盒说明书进行质粒提取。

菌种运输和储存

2. 甘油菌种（冰袋运输，存于-80℃，保质期90天）。按区域划线后挑取单菌落培养，酵母菌需先液体复苏再进行划线培养。

3. 穿刺菌种（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）。进行穿刺接种，液体培养后划线，再挑取单菌落液体培养。

4. 菌落平板（冰袋运输，存于4℃，保质期7天）。直接挑取单菌落至液体培养基中。

5. 液体质粒（冰袋运输，存于-20℃，保质期90天）。单独提取的液体质粒可以直接使用。

6. 滤纸质粒（常温运输，存于-20度，保质期90天）。请务必转化挑单克隆培养，切勿直接使用和测序。收到后，将滤纸圆圈部分剪下放入EP管中，加入100μL无菌水浸湿，浸泡5分钟，吸取5μL质粒进行转化，离心全涂。

质粒提取的实验原理与步骤

提取质粒时可采用碱裂解法，依据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA的拓扑差异进行分离。在pH值控制在120至125的范围内，线性DNA的双螺旋结构会解开并变性，而共价闭环质粒DNA则保持稳定。更具体的操作步骤如下：

1. 准备20mL灭菌培养管，编号并加入8mL LB培养基，随后加入8µL相应抗生素。
2. 用10µL枪头挑取单个菌落至培养管中，于37℃震荡培养过夜（274rpm）。
3. 取2mL过夜培养的菌液入离心管，以室温下10000rpm离心2分钟，去上清后进行重复，直至菌液处理完。
4. 在沉淀中加入250µL的BufferP1（含RNaseA），充分混匀以悬浮菌体。
5. 加入250µL BufferP2，轻柔上下颠倒混匀以获得澄清的裂解液。
6. 向离心管加入350µL BufferN3，立即轻柔混匀，并在室温下10000rpm离心15分钟，转移上清液至吸收柱。
7. 依次添加BufferPB和BufferPW清洗吸附柱，并在最后一步确保完全去除乙醇。
8. 用BufferEB进行洗脱，并于-40℃储存提取的质粒。

注意事项

在使用试剂盒前请将RNA酶加入BufferP1并保存在4℃；同时，BufferEB在65~70℃下的预热可提高提取效率。

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