第三章：实时荧光定量PCR的应用

一、相对定量

在不同样品中测定基因表达量的相对值是实时荧光定量PCR的重要应用之一。选择合适的内参基因至关重要，直接影响到实验结果的有效性。

内参基因选择原则：

1. 优先选择表达量高且稳定的基因作为内参基因。
2. 切勿盲目选择流行的内参基因。
3. 常见的内参基因包括GAPDH、Actin和Tublin。

在加入内参基因后，需对结果进行计算，以确保数据的科学性与准确性。

二、绝对定量

绝对定量是通过标准品来测定样品中基因表达量的绝对值（拷贝数）。可用作标准品的样品包括：

1. A/克隆质粒
2. B/PCR产物
3. C/cDNA（注意：扩增效率测定等用途使用，但绝对定量无法使用）

拷贝数的计算方法依据不同分子类型，其公式如下：

• 双链DNA（dsDNA）= (碱基数) x (660 道尔顿/碱基)
• 单链DNA（ssDNA）= (碱基数) x (330 道尔顿/碱基)
• 单链RNA（ssRNA）= (碱基数) x (340 道尔顿/碱基)

最终的拷贝数计算公式为：

(6.02 x 10²³ 拷贝数/摩尔) x (浓度 g/ml) / (MW g/mol) = copies/ml

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