酶联免疫吸附测定（ELISA，Enzyme-Linked Immunosorbent Assay）是一种基于抗原与抗体特异性结合的技术，通过将可溶性抗原或抗体固定在聚苯等固相载体上，实现对液体样本中目标抗原的定性和定量检测。ELISA的主要目的是检测血清、尿液及细胞上清液中的特定抗原，以获得定性判断的结果。

ELISA的原理在于将已知的抗原或抗体吸附至固相载体的表面，并在该表面开展酶标记的抗原抗体反应。实验操作上，首先设定标准孔、空白孔和样本孔。标准孔中加入100μL倍比稀释的标准品，而空白孔中加入100μL的标准品与样本稀释液，其他孔则加入100μL待测样本。为了确保结果的准确性，建议所有待检测样本和标准品都设立复孔，并通过预实验或咨询技术支持以确定样本的稀释倍数。

在此阶段，将酶标板封膜，并在37℃下孵育90分钟。需要注意的是，在添加样品时，应避免触碰孔壁，轻轻晃动以混匀样品，且加样时间应控制在10分钟以内。之后，甩净孔内液体，无需进行洗涤。接着，向每个孔中加入100μL生物素化抗体工作液，重新覆盖酶标板，并在37℃下温育1小时。

完成后，甩净孔内液体，并用洁净的吸水纸拍干。每孔中加入350μL洗涤液，浸泡1分钟后吸去液体，拍干。请重复这一洗涤步骤3次，建议使用洗板机以提高效率。在完成洗板后，请立即进行下步操作，避免微孔板干燥。随后，向每孔添加100μL HRP酶结合物工作液，再次封膜，并在37℃下温育30分钟。

洗净孔并进行5次洗涤，使用前面所述的洗涤步骤。每孔中添加90μL的底物溶液（TMB），然后在37℃下避光孵育约15分钟，根据实际显色情况适当调整时间，尽量控制在30分钟以内。当标准孔出现明显梯度时（如前四个显色孔呈现明显蓝色梯度），可以停止反应。此时，建议提前15分钟打开酶标仪进行预热。

往每孔添加50μL终止液，以终止反应。需要注意的是，终止液的加入顺序应尽量与底物溶液相同。最后，通过酶标仪在450nm波长下测量各孔的光密度（OD值）。由于实验条件的不同，标准曲线的OD值可能会有所变化，以下数据和曲线作为参考。

对于血清、血浆或其他液体样本，100μL通常够检测一个指标；而未经分离处理的样本，例如全血，1mL可以大约得到100-200μL的血清，具体取决于客户提供的样本情况。全血样本应保持在4℃并及时送检，其余液体样本应在-20℃下冷冻保存。对于组织样本，至少需要0.1g（约黄豆大小），最后可获得大约500μL的匀浆上清液，能够检测5个指标，并需在-20℃下冷冻保存以待送检。

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